Пкб что это такое: Рейтинг коллекторских агентств – список самых известных компаний-коллекторов на сайте НАО «ПКБ»

4517 просмотров

Статьи по теме

Новости партнёров

Глава Северного ПКБ: ракеты «Циркон» — наш козырь на очень серьезную перспективу

22 апреля исполняется 75 лет со дня основания Северного ПКБ. Это одно из крупнейших российских проектно-конструкторских бюро, образованное в 1946 году. Оно создает надводные корабли различных классов, в том числе сторожевики проекта 11356, новейшие фрегаты проекта 22350, модульные патрульные корабли проекта 22160. Накануне этой даты генеральный директор предприятия Андрей Дьячков рассказал в интервью ТАСС о том, над чем сейчас работают специалисты ведущего КБ России.

— Андрей Аркадьевич, над каким проектами работает Северное ПКБ в год своего 75-летнего юбилея?

— Со дня основания деятельность бюро была направлена на выполнение гособоронзаказа с целью повышения боеспособности советского Военно-морского флота. Сегодня специалисты бюро продолжают работу по обеспечению строительства серии фрегатов проекта 22350, а также сторожевых кораблей проекта 22160.

Ведутся модернизационные работы на крейсере «Адмирал Нахимов». Кроме того, очень серьезное направление нашей деятельности — это военно-техническое сотрудничество. Корабли, созданные в СПКБ, поставлялись в иностранные флоты начиная с конца 1950-х годов. Сегодня мы продолжаем осуществлять работы по реализации ряда контрактов с инозаказчиком.

— В чем заключается основная идея модернизации тяжелого атомного ракетного крейсера «Адмирал Нахимов» и нужны ли российскому флоту подобные ракетные крейсеры?

— Несмотря на появление новых современных кораблей, «кораблей XXI века», тяжелые атомные ракетные крейсеры проектов 1144 и 11442, спроектированные в Северном ПКБ, к которым относится, в частности, и «Адмирал Нахимов», по-прежнему являются «визитной карточкой», своеобразным символом не только нашего бюро, но и ВМФ России.

На эту тему

Высокий модернизационный потенциал этих кораблей, заложенный в них при проектировании, позволил провести определенные работы и оснастить «Адмирала Нахимова» самым современным оружием, что делает его сильнейшим боевым надводным кораблем мира. Это не раз отмечали в своих отчетах и рейтингах и иностранные специалисты, что можно отследить по публикациям в различных СМИ.

Несомненно, еще долгое время корабли с ракетным вооружением будут оставаться основной составляющей всех военных флотов мира. Вопрос заключается в том, каким оружием, какими комплексами мы будем оснащать корабли, создаваемые для ВМФ РФ, которые, по сути, являются для них платформами, носителями вооружения.

В 2020 году с борта спроектированного Северным ПКБ фрегата «Адмирал Горшков» был произведен первый успешный пуск гиперзвуковой ракеты «Циркон». «Циркон» — это наш сегодняшний козырь на очень серьезную перспективу. Характеристики этого комплекса пока еще никто не смог превзойти, и сегодня он выводит наш флот на совершенно новый уровень. Флот постоянно развивается, в том числе и за счет принятия на вооружение новых комплексов вооружения, а это означает, что в будущем боевые корабли будут иметь совершенно новые качества, нежели сегодня.

— Какие-то проекты Северного ПКБ сегодня проходят модернизацию, помимо «Адмирала Нахимова»?

— Следует отметить, что все корабли, спроектированные специалистами нашего бюро, обладают заложенным при проектировании высоким потенциалом модернизации. В 2020 году завершены ремонт и модернизация большого противолодочного корабля проекта 1155 «Маршал Шапошников». На него были установлены новые комплексы вооружения, значительно повысившие боевые возможности проекта. Теперь он может выполнять задачи ударного корабля дальней морской зоны.

— Запланировано продолжение серии фрегатов проекта 22350. Будут ли новые корабли серии отличаться от предыдущих?

— Фрегат проекта 22350 «Адмирал Горшков», головной в серии, привлек к себе пристальное внимание специалистов всего мира в 2019 году, когда он совершил кругосветный поход, что было признано достижением и занесено в Книгу рекордов Вооруженных сил Российской Федерации. Подобные операции не проводились со времен распада Советского Союза. Во время похода корабль доказал свои отличные ходовые качества и надежность, правильность заложенных в него инженерных решений.

Вскоре фрегаты проекта 22350 должны стать основой надводных группировок флота России. В настоящее время продолжаются работы над шестью кораблями серии. Новые фрегаты  будут отличаться составом вооружения, что существенно усилит потенциал как самих кораблей, так и группировок, в состав которых они войдут, придаст им новые возможности и позволит решать дополнительные задачи.

Кроме того, те корабли, которые сегодня строятся серийно, будут иметь, в отличие от головного фрегата, полностью отечественную главную энергетическую установку

— Будет ли продолжение у серии кораблей 22460 для пограничников?

— На сегодняшний момент Пограничной службе ФСБ России передано уже более десяти кораблей. Все они прекрасно себя зарекомендовали. Их ходовые качества, условия обитаемости позволяют им эффективно выполнять задачи на всех морях, практически в любых условиях. Корабли проекта 22460 служат сегодня и на Черном море, и на Севере. В этом году на Международном военно-морском салоне, который пройдет в Санкт-Петербурге в конце июня, мы покажем обновленный проект корабля, который будет существенно отличаться от тех, что уже построены.

— В СМИ сообщалось, что возможно продолжение строительства сторожевых кораблей проекта 22160. Что поменяется в кораблях, которые будут строиться после первых шести?

— Первые шесть кораблей серии строились в соответствии с техническим заданием, которое было выдано нам заказчиком — ВМФ РФ. Именно под  цели и задачи, им определенные, и был выбран оптимальный состав вооружения и оборудования корабля.

В дальнейшем, если у заказчика появится потребность в наличии дополнительного количества кораблей проекта 22160 и для них будут определены дополнительные задачи, то, соответственно, будет проведен «рестайлинг» проекта, он получит новые возможности.

Причем сделать это будет относительно несложно, поскольку все наши корабли спроектированы как базовые платформы с открытой архитектурой с возможностью установки разных комплексов вооружения и систем

За счет этого данный проект привлекателен и для инозаказчиков, поскольку позволяет реализовать их требования применительно к установке того набора вооружения и оборудования, который они посчитают оптимальным для себя.

— Какие версии российских кораблей вам приходилось адаптировать для иностранных заказчиков? В чем заключалась такая адаптация? Когда были созданы эти проекты? Корабли уже поставлены заказчикам?

— Бюро имеет богатую историю военно-технического сотрудничества с зарубежными странами. Начиная с 1957 года созданные в СПКБ корабли поставлялись Болгарии, Польше, ГДР, Египту, Индонезии, Финляндии, Вьетнаму. Особого внимания заслуживает тема сотрудничества с Республикой Индия и КНР.

На основании распоряжения Совета Министров СССР в 1975 году Северному ПКБ было поручено разработать проект противолодочного корабля с ударными возможностями для Республики Индия. В результате в 1980–1988 годах заказчику было передано пять кораблей проекта 61МЭ.

В 1997–1999 годах для ВМС Республики Индия был разработан принципиально новый фрегат проекта 11356. В 2003–2004 годах и в 2012–2013 годах две серии из трех кораблей в каждой переданы ВМС Индии.

В 1996-м специалисты Северного ПКБ разработали проект патрульно-сторожевого корабля ПС-500, который в 2001-м передали ВМС Республики Вьетнам. В 1997 году в Бюро началась разработка технического проекта двух эскадренных миноносцев проекта 956Э. Эти корабли были переданы Китайской Народной Республике в 1999–2000 годах.

По результатам успешного сотрудничества с КНР в январе 2002 года был заключен новый контракт на разработку документации и поставку еще двух кораблей проекта 956ЭМ с усовершенствованными комплексами ударного и зенитного вооружения. Корабли были построены и переданы ВМС КНР в 2005 и 2006 годах соответственно.

Без преувеличения можно сказать, что создание основы ВМС Китая и становление индийского военно-морского флота — заслуга специалистов Северного ПКБ. В настоящий момент продолжается работа по реализации ряда контрактов с инозаказчиком.

Компании: НАО «ПКБ»

Национальная шкала	Прогноз	Рейтинг под наблюдением	Дата
отозван отозван, 21. 07.2021	—	—	21.07.2021
ruBBB ruBBB, Развивающийся, 22.07.2020	Развивающийся	—	22.07.2020
отозван отозван, 24. 09.2019	—	—	24.09.2019
ruA- ruA-, Стабильный, Наблюдение снято, 24.09.2019	Стабильный	Наблюдение снято	24.09.2019
ruA- ruA-, Стабильный, Рейтинг под наблюдением, 11. 07.2019	Стабильный	Рейтинг под наблюдением	11.07.2019
ruA- ruA-, Стабильный, Рейтинг под наблюдением, 16.05.2019	Стабильный	Рейтинг под наблюдением	16.05.2019
ruA- ruA-, Стабильный, Рейтинг под наблюдением, 15. 02.2019	Стабильный	Рейтинг под наблюдением	15.02.2019
ruA- ruA-, Стабильный, 20.09.2018	Стабильный	—	20.09.2018

ПКБ «РЭМ» (Проектно-конструкторское бюро «Росэнергомонтаж»)

ООО «Проектно-конструкторское бюро «Росэнергомонтаж» (ООО «ПКБ «РЭМ») – многопрофильная производственная Компания, реализующая сложные комплексные проекты в области энергетики. 

Компания основана в 2007 году.

Основные направления деятельности:

• Проектирование систем электроснабжения объектов среднего и низкого напряжения;
• Монтажные и наладочные работы на подстанциях, кабельных и воздушных линиях 330 кВ и ниже;
• Испытание кабелей с СПЭ изоляцией высоким напряжением;
• Диагностика методом частичных разрядов КЛ 330 кВ и ниже, оборудования ПС;
• Определение места повреждения кабеля;
• Техническое обслуживание и текущий ремонт электрооборудования.

Профессионализм специалистов и современная техническая база позволяют на высоком уровне выполнять весь комплекс электромонтажных работ на любых энергетических объектах, гибко реагировать на изменения ситуации в отрасли, находить новые возможности для расширения спектра деятельности. 

Наша электролаборатория (ЭЛ) это: высокотехнологичное оборудование ведущих мировых производителей, квалифицированный персонал и бесценный многолетний опыт работы. Нашей ЭЛ производились работы по определению мест повреждения кабельных линий 0,4; 6-10; 35; 110; 220 и 330 кВ (в том числе кабели с изоляцией из сшитого полиэтилена) с неизменным успехом. Наши специалисты проводят испытание кабеля сверхнизкой частотой 0,1 Гц и диагностику методом частичных разрядов кабеля с изоляцией из сшитого полиэтилена до 220 кВ. Наша организация одной из первых освоила новые перспективные методы диагностики кабельных линий, позволяющие, в отличие от испытаний, не нанося ущерба, определять общий ресурс изоляции кабеля и отдельные дефектные участки на его длине. Работы по диагностике электрооборудования были успешно проведены на кабельных линиях ряда предприятий России.

Компания имеет сертификаты соответствия системе менеджмента качества, системе управления охраной труда и промышленной безопасности по стандартам ISO 9001-2008 и OHSAS 18001-2007. Выполнение работ в отношении опасных, технически сложных и уникальных объектов соответствует международному стандарту экологического менеджмента ISO14001-2004. Необходимая разрешительная документация позволяет ООО «ПКБ «РЭМ» осуществлять деятельность с функциями генподрядчика.

Основная цель ООО «ПКБ «РЭМ» — комплексный подход к решению поставленных Заказчиком задач, применение передовых технологий и внедрение новейших решений для качественного выполнения всех требований деловых партнеров. 

ООО «ПКБ «РЭМ» – компания, стабильно работающая в области энергетического строительства, ремонта, реконструкции, технического перевооружения электроэнергетических объектов. Компания реализует проекты полного цикла: от обследования до монтажа и пусконаладочных работ на всем технологическом, вспомогательном оборудовании. Иными словами, мы предлагаем нашим клиентам решение задач электроснабжения объектов любой сложности «под ключ».

Реализованы проекты

Строительство и реконструкции кабельных и воздушных линий 330 кВ и ниже: 

КЛ 110 кВ Левобережная, КВЛ 110 кВ Парголовская-3, ВЛ 330 кВ КАЭС-Южная-2, ВЛ 220 кВ Тамбовская-2, Стрелецкая-1, Западная, Стрелецкая-1 и другие.

Реконструкция подстанций: 

ПС 110 кВ Новозападная, ПС 220 кВ Приморская, ПС 220 кВ Левобережная и др.  

Диагностика и определение мест повреждения КЛ 330 кВ и ниже:

Кабельные вставки на ПС 330 кВ Парнас, КЛ 6 – 110 кВ ОАО «Ленэнерго», КЛ 110 кВ на Олимпийских объектах г. Сочи, КЛ 35 кВ ООО «Лукойл-Энергосети», КЛ 110 кВ ГУП «Водоканал Санкт-Петербурга», КЛ 110 кВ ООО «Балтнефтепровод», ГУП «Петербургский метрополитен» и другие.

Внутриплощадочные инфраструктуры:

ОАО Газпром «Северо-Европейского газопровода. Участок Грязовец-Выборг» КС Грязовецкая и КС «Портовая»; «Южный поток» КС «Русская» и КС «Писаревка» и другие.

Наши заказчики

ОАО «Ленэнерго», Филиалы ОАО «ФСК ЕЭС» – МЭС Северо-Запада, МЭС Центра, ООО «Балтнефтепровод», ОАО «Газпром», ЗАО «Петербургский нефтяной терминал», ОАО «Кубаньэнерго», ОАО «ТГК-1», Юго-Западная ТЭЦ, ЗАО «Ойкумена» и другие.

Детский самокат Polaris PKB 0301B

Детский самокат Polaris PKB 0301B

Обзор

Детский самокат Polaris PKB 0301B приятного голубого цвета понравится и мальчикам, и девочкам.

Данная модель предназначена для детей от 2 до 6 лет. По мере того, как малыш растет, вы сможете регулировать высоту руля – максимально ее можно поднять до 76см.

• Самокат сделан из алюминия и стали, что обеспечивает его надежность и долговечность. Он прослужит до тех пор, пока не придет время выбирать модель побольше. Самокат Polaris PKB 0301B рассчитан на вес ребенка до 40кг.
• Цельнолитые колеса обеспечивают комфортную и нешумную езду, поглощая неровности дороги. А их цветная подсветка понравится и владельцу, и наблюдателям. Средний размер колес  (9см в диаметре) позволяет быстро разгоняться на асфальте.
• Задние колеса сдвоенные – это помогает самым маленьким водителям держать равновесие и обеспечивает дополнительную устойчивость при езде. Крылья над колесами защитят от брызг и в то же время служат ножным тормозом.

Особенности детского самоката Polaris PKB 0301B

На ручках самоката мягкое нескользящее покрытие, чтобы держаться было тепло и удобно. Около ручек располагается звонок – не только полезная вещь, но и дополнительный источник веселья.

Для удобства хранения предусмотрена возможность сложить самокат. В сложенном виде он достаточно компактный, чтобы не занимать много места у вас дома.

Технические характеристики

Габариты

pH, pKa, Ka, pKb и Kb объяснены

В химии есть соответствующие шкалы, которые используются для измерения кислотности или щелочности раствора, а также силы кислот и оснований. Хотя шкала pH наиболее известна, pKa, Ka, pKb и Kb являются общими расчетами, которые позволяют лучше понять кислотно-основные реакции. Вот объяснение терминов и того, чем они отличаются друг от друга.

Что означает буква «p»?

Всякий раз, когда вы видите «p» перед значением, например pH, pKa или pKb, это означает, что вы имеете дело с -log значения, следующего за «p».Например, pKa — это логарифм Ka. Из-за того, как работает функция журнала, меньшее значение pKa означает большее значение Ka. pH — это логарифм концентрации ионов водорода и т. д.

Формулы и определения для pH и константы равновесия

pH и pOH связаны так же, как Ka, pKa, Kb и pKb. Если вы знаете pH, вы можете рассчитать pOH. Если вам известна константа равновесия, вы можете вычислить остальные.

О pH

pH — это мера концентрации ионов водорода [H +] в водном (водном) растворе.Шкала pH находится в диапазоне от 0 до 14. Низкое значение pH указывает на кислотность, pH 7 — нейтральный, а высокое значение pH указывает на щелочность. Значение pH может сказать вам, имеете ли вы дело с кислотой или основанием, но оно предлагает ограниченное значение, указывающее на истинную силу кислоты основания. Формулы для расчета pH и pOH:

pH = — log [H +]

pOH = — log [OH-]

При 25 градусах Цельсия:

pH + pOH = 14

Понимание Ka и pKa

Ka, pKa, Kb и pKb наиболее полезны при прогнозировании того, будет ли вид отдавать или принимать протоны при определенном значении pH.Они описывают степень ионизации кислоты или основания и являются истинными индикаторами силы кислоты или основания, поскольку добавление воды к раствору не изменяет константу равновесия. Ka и pKa относятся к кислотам, а Kb и pKb относятся к основаниям. Как и pH и pOH, эти значения также учитывают концентрацию ионов водорода или протонов (для Ka и pKa) или концентрацию гидроксид-иона (для Kb и pKb).

Ka и Kb связаны между собой ионной постоянной для воды, Kw:

Ka — константа диссоциации кислоты.pKa — это просто -log этой константы. Точно так же Kb — это константа диссоциации оснований, а pKb — логарифм константы. Константы диссоциации кислоты и основания обычно выражаются в молях на литр (моль / л). Кислоты и основания диссоциируют по общим уравнениям:

• HA + H ₂ O ⇆ A ^— + H ₃ O ⁺
• HB + H ₂ O ⇆ B ⁺ + OH ^—

В формулах A означает кислоту, а B — основание.

• Ka = [H +] [A -] / [HA]
• pKa = — лог Ka
• в половине точки эквивалентности, pH = pKa = -log Ka

Большое значение Ka указывает на сильную кислоту, потому что это означает, что кислота в значительной степени диссоциирована на свои ионы. Большое значение Ka также означает, что образование продуктов в реакции благоприятствует. Небольшое значение Ka означает, что кислота не диссоциирует, поэтому у вас слабая кислота. Значение Ka для большинства слабых кислот колеблется от 10 ^-2 до 10 ^-14 .

PKa дает ту же информацию, только по-другому. Чем меньше значение pKa, тем сильнее кислота. Слабые кислоты имеют pKa от 2 до 14.

Общие сведения о Kb и pKb

Kb — константа диссоциации оснований. Константа диссоциации основания — это мера того, насколько полностью основание диссоциирует на составляющие ионы в воде.

• Кб = [B +] [OH -] / [BOH]
• pKb = -log Kb

Большое значение Kb указывает на высокий уровень диссоциации сильного основания.Более низкое значение pKb указывает на более сильное основание.

pKa и pKb связаны простым соотношением:

Что такое pI?

Еще один важный момент — pI. Это изоэлектрическая точка. Это pH, при котором белок (или другая молекула) электрически нейтрален (не имеет чистого электрического заряда).

pH, pKa, Ka, pKb и Kb в химии.

pH, pKa, pKb, Ka и Kb используются в химии для описания кислотности или щелочности раствора и для измерения силы кислот и оснований.Шкала pH является наиболее известным показателем кислотности и основности, но pKa, pKb, Ka и Kb лучше подходят для прогнозирования силы кислоты и основания и их реакций. Вот определения каждого термина, простые формулы, используемые для их вычисления, и объяснение того, чем они отличаются друг от друга.

Что означают буквы «p» и «K»

Во-первых, полезно разобраться в символах. Когда вы видите «p» в кислотно-щелочной химии, эта буква означает «мощность». Итак, pH — это «сила водорода», где H — символ элемента.«P» перед значением также указывает -log значения. Таким образом, pH — это отрицательный логарифм концентрации ионов водорода, а pKa — это отрицательный логарифм значения Ka. Заглавная буква «К» означает постоянную. В данном случае это относится к константе равновесия. Прописные и строчные буквы «А» или «а» и «В или« b »обозначают кислоту и основание соответственно.

pH и константа равновесия

pKa, pKb, Ka и Kb — все константы равновесия. В частности, они представляют собой константы равновесия, которые являются константами диссоциации.Обычно они выражаются в моль на литр (моль / л). Так же, как pH и pOH связаны друг с другом, если вы знаете одну константу диссоциации, вы можете решить другие.

pKa, Ka, pKb и Kb используются для прогнозирования того, будут ли химические частицы отдавать или принимать протоны (катионы водорода) при заданном значении pH. Другими словами, константы равновесия указывают силу кислоты и основания и описывают уровень ионизации кислоты или основания. pKa и Ka описывают кислоты, а pKb и Kb описывают основания.Как и pH, значения pKa и Ka учитывают концентрацию ионов водорода. Как и pOH, значения pKb и Kb учитывают концентрацию гидроксид-иона. Имея дело с константой равновесия, помните, что добавление воды к водному раствору кислоты или основания не изменяет его константу равновесия. Ka и Kb связаны ионной постоянной для воды (Kw):

Kw = Ka x Kb

Определение pH и формула

pH — это мера концентрации ионов водорода [H +], которая, в свою очередь, является показателем того, как кислотный или щелочной химический раствор.Обычно шкала pH варьируется от 0 до 14, хотя на самом деле можно получить отрицательные значения и значения, превышающие 14. Значение pH около 7 является нейтральным (ни кислым, ни основным), значение pH менее 7 является кислым, а значение pH значение больше 7 является основным. Значение pH показывает, является ли химическое вещество кислотой или основанием, но не указывает на силу кислоты или основания. pH связан с pOH, который представляет собой мощность гидроксид-иона [OH-] и используется при обсуждении оснований. Формулы для расчета pH и pOH:

pH = — log [H +]
pOH = — log [OH-]

При 25 градусах Цельсия:
pH + pOH = 14

pKa и Ka

Ka — это константа диссоциации кислоты.pKa — это просто -log этой константы. Кислота диссоциирует согласно общему уравнению:

HA + H ₂ O ⇆ A ^— + H ₃ O ⁺

Где:

Ka = [H +] [A -] / [HA ]
pKa = — log Ka
в половине точки эквивалентности, pH = pKa = -log Ka

Большое значение Ka указывает на сильную кислоту, потому что это означает, что кислота в значительной степени диссоциирует на свои ионы. Большое значение Ka также означает, что стрелка реакции способствует формированию продукции.Напротив, небольшое значение Ka означает, что диссоциирует только небольшое количество кислоты, что указывает на слабую кислоту. Небольшое значение Ka означает, что реакция благоприятствует реагентам, а не продуктам. Большинство слабых кислот имеют значения Ka от 10 ^-2 до 10 ^-14 .

pKa дает ту же информацию, но другим способом. Чем меньше значение pKa, тем сильнее кислота. Или, чем больше значение pKa, тем слабее кислота. Слабые кислоты обычно имеют значения pKa от 2 до 14.

pKb и Kb

Kb — константа диссоциации оснований, а pKb — логарифм этой константы.Основание диссоциирует согласно общему уравнению:

HB + H ₂ O ⇆ B ⁺ + OH ^—

Где:

Kb = [B +] [OH -] / [BOH]
pKb = -log Kb

Константы диссоциации оснований интерпретируются так же, как константы диссоциации кислоты. Большое значение Kb означает, что основание в значительной степени диссоциировано, и указывает на сильное основание. Маленькое значение pKb указывает на сильное основание, в то время как большое значение pKb указывает на слабое основание.

pKa и pKb связаны с помощью простого уравнения:

pKa + pKb = 14

Что такое pI?

pI — еще одно полезное значение.pI обозначает изоэлектрическую точку. Это значение pH, при котором молекула (обычно белок) электрически нейтральна и имеет нулевой чистый электрический заряд. Для аминокислоты, содержащей одну аминогруппу и одну карбоксильную группу, pI рассчитывается из среднего или среднего значений pKa для молекулы:

pI = (pKa1 + pKa2) / 2

Ссылки

• Atkins, Peter ; де Паула, Хулио (2006). Физическая химия . Оксфорд. ISBN 978-0198700722.
• Денби, К.(1981). «Глава 4.» Принципы химического равновесия (4-е изд.). Кембридж: Издательство Кембриджского университета. ISBN 978-0-521-28150-8.
• Himmel, D .; Goll, S.K .; Leito, I .; Кроссинг, И. (2010). «Единая шкала pH для всех фаз». Angew. Chem. Int. Эд . 49 (38): 6885–6888. DOI: 10.1002 / anie.201000252
• Козловский, Л.П. (2016). «IPC — Калькулятор изоэлектрической точки». Биол Директ . 11 (1): 55. doi: 10.1186 / s13062-016-0159-9
• Лейдлер К.Дж. (1987). Chemical Kinetics (3-е изд.) Harper & Row. ISBN: 0-06-043862-2.

Предупреждение : file_get_contents (http: // files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference-between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference- between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в / home / diffbw / webapps / diffbw_wp / awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference-between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открытый поток: HTTP-запрос не удался! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference- between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http://files.differencebetween.com/wp-content/uploads/2018/02/difference- between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Предупреждение : file_get_contents (http: //files.differencebetween.com / wp-content / uploads / 2018/02 / difference-between-pka-and-pkb.pdf): не удалось открыть поток: сбой HTTP-запроса! HTTP / 1.1 403 Запрещено в /home/diffbw/webapps/diffbw_wp/awsfiles.php в строке 20

Константы равновесия Ka и Kb Pka Pkb — Кислотно-основное равновесие

Константа диссоциации кислоты (Ka) — это количественная мера силы кислоты в растворе, а константа диссоциации основания (Kb) — это мера основности — общей прочности основания.

Ka и pKa
Кислоты классифицируются как сильные или слабые в зависимости от их ионизации в воде. Сильная кислота — это кислота, которая полностью ионизируется в водном растворе. Слабая кислота — это кислота, которая лишь незначительно ионизируется в водном растворе.

Ионизацию общей слабой кислоты HA можно записать следующим образом:

Поскольку кислота слабая, можно записать выражение равновесия. Константа ионизации кислоты ( K _a ) — константа равновесия для ионизации кислоты.

Ионизация кислоты представляет собой долю исходной кислоты, которая была ионизирована в растворе. Следовательно, числовое значение K _a является отражением силы кислоты. Слабые кислоты с относительно более высокими значениями K _a сильнее кислот с относительно более низкими значениями K _a . Поскольку сильные кислоты ионизированы на 100%, концентрация кислоты в знаменателе почти равна нулю, а значение K _a приближается к бесконечности.По этой причине значения K _a обычно приводятся только для слабых кислот.

Логарифмическая константа ( pKa ) равна -log10 (Ka). Чем больше значение pKa, тем меньше степень диссоциации . Слабая кислота имеет значение pKa в диапазоне от -2 до 12 в воде. Кислоты со значением pKa менее примерно -2 считаются сильными кислотами.

Kb и pKb
Как и в случае с кислотами, основания могут быть сильными или слабыми, в зависимости от степени их ионизации.Сильное основание — это основание, которое полностью ионизируется в водном растворе. Слабое основание — это основание, которое лишь незначительно ионизируется в водном растворе.

Выражение равновесия может быть записано для реакций слабых оснований с водой. Поскольку концентрация воды чрезвычайно велика и практически постоянна, вода не включается в выражение. Константа ионизации основания ( K _b ) — константа равновесия для ионизации основания.

pKb можно рассчитать как pKb = -log ₁₀ (Kb). Большое значение Kb указывает на высокий уровень диссоциации сильного основания. Более низкое значение pKb указывает на более сильное основание.

Поскольку эти реакции происходят в водных растворах, вода не включается в уравнение, даже если она является частью реакции. Он считается растворителем в этих реакциях, поэтому концентрация остается практически постоянной.

Практические вопросы

Ханская академия

Официальная подготовка MCAT (AAMC)

Пакет вопросов по химии Отрывок 13, вопрос 77

Пакет вопросов по химии Отрывок 16, вопрос 88

Образец теста C / P Раздел Отрывок 6 Вопрос 30

Практический экзамен 1 Раздел C / P, вопрос 13

Практический экзамен 3 Раздел C / P, вопрос 12

Практический экзамен 4 Раздел C / P Отрывок 1 Вопрос 2

Практический экзамен 4 Раздел C / P Отрывок 4 Вопрос 18

Ключевые точки

• Ka константа диссоциации кислоты и Kb константа диссоциации основания являются мерой степени диссоциации слабой кислоты или основания в равновесии.

• pKa и pKb — логарифмические шкалы Ka и Kb.

• Kb связано с константой кислотной диссоциации Ka простым соотношением pKa + pKb = 14, где pKb и pKa — отрицательные логарифмы Kb и Ka, соответственно.

• Kb и Ka также связаны через ионную константу для воды, Kw, соотношением Kw = Kb x Kb = a

Ключевые термины

Диссоциация : процесс, при котором соединения расщепляются на более мелкие составляющие молекулы, обычно обратимо.

Слабая кислота : та, которая не полностью диссоциирует, отдавая только часть своих ионов водорода в раствор

Слабое основание : акцептор протонов, который не полностью ионизируется в водном растворе

Равновесие : Состояние реакции, в котором скорости прямой и обратной реакций равны.

pKa : количественный показатель силы кислоты в растворе; слабая кислота имеет значение pKa в приблизительном диапазоне от -2 до 12 в воде, а сильная кислота имеет значение pKa менее примерно -2.

Константа ионизации основания ( K _b ) : Константа равновесия для ионизации основания.

Что такое pKb основания, конъюгированная кислота которого имеет pKa 11,54?

Вопрос:

Что такое pKb основания, конъюгированная кислота которого имеет pKa 11,54?

Кислотно-основное равновесие.

Кислота в водном растворе дает протон, а основание принимает его.{- 14} {/ eq}

Следующее математическое выражение получено из приведенного выше уравнения.

{eq} pk_a + pk_b = 14 {/ eq} Мы можем показать реакцию диссоциации кислоты и ее сопряженного основания следующим образом. Здесь ,

{eq} pka = — \ log (k_a) \ и \ pk_b = — \ log (k_b) {/ eq}

Мы можем показать реакцию диссоциации кислоты и ее сопряженного основания следующим образом.

Реакция диссоциации кислоты:

Предположим, что HA — это слабая кислота.

{eq} \ text {HA} \ left (\ text {aq} \ right) + H_ {2} O \ left (l \ right) \ rightarrow A ^ {-} \ left (\ text {aq} \ right ) + H_ {3} O ^ {+} \ left (\ text {aq} \ right) {/ eq}

{eq} k_a = \ frac {\ left \ lbrack A ^ {-} \ right \ rbrack \ left \ lbrack H_ {3} O ^ {+} \ right \ rbrack} {\ lbrack HA \ rbrack} {/ eq}

Здесь {eq} A ^ — {/ eq} (водн.) представляет собой основание, сопряженное с кислотой HA ?.{- 14}) {/ eq} Мы знаем,

{eq} — \ log (k_a) = pk_a \ и — \ log (k_b) = pk_b {/ eq}

Итак,

{eq} pk_a + pk_b = 14 {/ eq}

Ответ и объяснение: 1

Дано:

{eq} pk_a {/ eq} = 11,54

Чтобы определить: {eq} pk_b {/ eq} (сопряженное основание)

Шаг 1

Используйте следующее выражение.

{eq} pk_a + pk_b = 14 {/ eq}

ул…

См. Полный ответ ниже.

PI3K-PKB / Akt Pathway

Abstract

Протеинкиназа B (PKB или Akt) играет роль в метаболизме, росте, пролиферации и выживании клеток. Его активация контролируется многоступенчатым процессом, в котором участвует фосфоинозитид-3-киназа (PI3K).

Идентификация пути фосфоинозитид-3-киназа-протеинкиназа B / Akt (PI3K-PKB / Akt) и активация рецепторных тирозинкиназ (RTK) началась всерьез в начале 1980-х годов с энергичных попыток охарактеризовать передачу сигналов рецептора инсулина (для обзора см. Alessi 2001; Brazil and Hemmings 2001).Эти скромные начинания привели к идентификации компонентов и механизма передачи сигналов рецептора инсулина через белки субстрата инсулинового рецептора (IRS) к PI3K и последующей PKB / Akt-опосредованной активации 3-фосфоинозитид-зависимой протеинкиназой 1 (PDK1). С открытием мощного вклада активации PI3K и PKB / Akt в онкогенез интенсивные исследования регуляции этого пути привели к открытию негативных регуляторов, протеинфосфатазы 2 (PP2A), фосфатазы и гомолога тензина (PTEN), и протеинфосфатазы, содержащие богатые лейцином повторы PH-домена (PHLPP1 / 2).Совсем недавно были идентифицированы неуловимые киназы гидрофобных мотивов PKB / Akt, т. Е. Мишень рапамицина у млекопитающих (mTOR), когда они связаны с комплексом mTOR 2 (mTORC2), и ДНК-зависимая протеинкиназа (DNA-PK), как и способность Ras влиять на путь PI3K-PKB / Akt через PI3K, завершая нашу текущую модель пути PI3K-PKB / Akt.

Путь PI3K-PKB / Akt является высококонсервативным, и его активация строго контролируется посредством многоступенчатого процесса (как показано на рисунке). Активированные рецепторы напрямую стимулируют PI3K класса 1A, связанные через их регуляторную субъединицу или адаптерные молекулы, такие как субстрат рецептора инсулина ( IRS) белки.Это запускает активацию PI3K и превращение его каталитическим доменом фосфатидилинозитол (3,4) -бисфосфатных (PIP ₂ ) липидов в фосфатидилинозитол (3,4,5) -трифосфат (PIP ₃ ). PKB / Akt связывается с PIP ₃ на плазматической мембране, позволяя PDK1 получать доступ и фосфорилировать T308 в «петле активации», что приводит к частичной активации PKB / Akt (Alessi et al. 1997). Эта модификация PKB / Akt достаточна для активации mTORC1 путем прямого фосфорилирования и инактивации богатого пролином субстрата Akt 40 кДа (PRAS40) и белка 2 туберозного склероза (TSC2) (Vander Haar et al.2007). Субстраты mTORC1 включают эукариотический фактор инициации трансляции 4E, связывающий белок 1 (4EBP1) и киназу рибосомного белка S6, 70 кДа, полипептид 1 (S6K1), который, в свою очередь, фосфорилирует рибосомный белок S6 (S6 / RPS6), способствуя синтезу белка. и клеточная пролиферация.

Активация PKB / Akt ниже RTK через путь P13K.

Фосфорилирование Akt по S473 в карбоксиконцевом гидрофобном мотиве либо с помощью mTOR (Sarbassov et al. 2005), либо с помощью DNA-PK (Feng et al.2004), стимулирует полную активность Akt. Полная активация Akt ведет к дополнительным событиям субстрат-специфического фосфорилирования как в цитоплазме, так и в ядре, включая ингибирующее фосфорилирование проапоптотических белков FOXO (Guertin et al. 2006). Полностью активный PKB / Akt опосредует многочисленные клеточные функции, включая ангиогенез, метаболизм, рост, пролиферацию, выживаемость, синтез белка, транскрипцию и апоптоз (как показано в). Дефосфорилирование T308 PP2A (Andjelković et al. 1996) и S473 PHLPP1 / 2 (Brognard et al.2007), а превращение PIP ₃ в PIP ₂ с помощью PTEN (Stambolic et al. 1998) антагонистирует передаче сигналов Akt.

Сигнальные события, активирующие PKB / Akt и клеточные функции, регулируемые PKB / Akt.

Ингибирование протеинкиназы B (PKB) и PKCζ опосредует остановку клеточного цикла, вызванную кератином K10

Abstract

Промежуточный цитоскелет филаментов состоит из кератинов во всех эпителиальных клетках и придает этим клеткам механическую целостность. Однако, помимо этой общей функции, функциональное значение тщательно регулируемой тканевой и специфической для дифференцировки экспрессии большого семейства кератиновых белков цитоскелета остается неясным.Недавно мы продемонстрировали, что экспрессия кератина K10 или K16 может регулировать фосфорилирование белка ретинобластомы (pRb), ингибируя (K10) или стимулируя (K16) пролиферацию клеток (JM Paramio, ML Casanova, C. Segrelles, S. Mittnacht, EB Lane , и JL Jorcano, Mol. Cell. Biol., 19: 3086–3094, 1999). Здесь мы показываем, что функция кератина K10 как отрицательного модулятора прогрессирования клеточного цикла включает изменения в пути передачи сигнала фосфоинозитид-3-киназы (PI-3K). Физическое взаимодействие K10 с Akt (протеинкиназа B [PKB]) и атипичным PKCζ вызывает секвестрацию этих киназ в цитоскелете и ингибирует их внутриклеточную транслокацию.Как следствие, экспрессия K10 ухудшает активацию PKB и PKCζ. Мы также демонстрируем, что это ингибирование препятствует фосфорилированию pRb и снижает экспрессию циклинов D1 и E. Функциональные и биохимические данные также демонстрируют, что взаимодействие между K10 и этими киназами включает не-спиральный амино-домен K10 (NTerm). Вместе эти результаты предполагают новые и важные роли кератинов как модуляторов специфических путей передачи сигналов.

Кератины образуют цитоскелет промежуточных филаментов всех эпителиальных клеток.Хотя было продемонстрировано, что эта структура важна для обеспечения устойчивости клеток в эпителии (11, 13), имеется мало информации об отдельных кератино-специфических функциях, которые могут объяснить сложные паттерны экспрессии, специфичные для типа клеток и дифференцировки, наблюдаемые в этой области. семейство белков. Экспрессия кератина строго регулируется в эпидермисе. Пролиферативные базальные клетки экспрессируют кератиновую пару, состоящую из K5 и K14 (пара K5-K14). Однако, когда кератиноциты начинают терминальную дифференцировку, они перемещаются вверх, становятся постмитотическими и переключаются на экспрессию кератиновой пары K1-K10.В условиях гиперпролиферации (например, при опухолях и заживлении ран) кератиноциты подавляют регуляцию K1-K10 и экспрессируют K6-K16. Недавно мы показали, что эктопическая экспрессия кератина K10 подавляет пролиферацию кератиноцитов человека, в то время как экспрессия K16 стимулирует этот процесс (23). В соответствии с этим, K10 ухудшает развитие опухоли кожи, когда эктопически экспрессируется у трансгенных мышей (29), а избыточная экспрессия K16 или эктопическая экспрессия у трансгенных мышей приводит к аберрантной эпидермальной кератинизации и гиперпролиферации (19, 30).

Индуцированное кератином K10 ингибирование пролиферации клеток происходит через процесс, связанный с белком ретинобластомы (pRb) и молекулярным механизмом, контролирующим развитие клеточного цикла во время G ₁ (23). Различное клеточное распределение кератинов (цитоплазматический) и pRb (ядерный), тем не менее, предполагает, что этот эффект должен происходить через K10-опосредованное нарушение пути, ведущего к функциональной инактивации pRb, а не за счет прямого физического взаимодействия этих двух молекул.Мы выбрали онкоген-зависимый путь ras на основании ряда открытий, которые предполагают, что K10 и ras могут иметь антагонистические функции в пролиферации и дифференцировке кератиноцитов. Во-первых, передача сигналов Ha-ras участвует в контроле развития клеточного цикла pRb-зависимым образом (18, 28), подобным тому, что описано для K10 (23). Во-вторых, в то время как мутации в Ha-ras являются ранними и важными событиями в протоколах канцерогенеза кожи мышей (3), K10 теряется на ранних стадиях развития опухоли.В-третьих, хотя K10 экспрессируется в постмитотических, терминально дифференцирующихся эпидермальных клетках, у трансгенных мышей, экспрессирующих мутантный ген Ha-ras от промотора K10, развивается генерализованный гиперкератоз кожи, а также опухоли кожи (2). Поскольку ras-зависимые митогенные сигналы расходятся по разным путям (см. Обзоры ссылки 7 и 17), например, для малых GTPases, raf и фосфоинозитид-3-киназы (PI-3K), мы изучили, на какой из этих путей специфически влияет Выражение K10.Собранные данные ясно демонстрируют, что кератин K10 ухудшает развитие клеточного цикла за счет секвестрации и ингибирования протеинкиназы B (PKB; Akt) и атипичного PKCζ.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Плазмиды и трансфекции.

Плазмиды, кодирующие кератины K1, K10 и K16, были описаны ранее (23). Плазмиды, кодирующие дикого типа (wt) и доминантно-отрицательные активированные Ha-ras, v-raf и PKCζ, были предоставлены J. Moscat (Centro de Biologia Molecular, Мадрид, Испания).Эти плазмиды, кодирующие активированные формы RhoA, Rac1 и Cdc42Hs, были любезно предоставлены JC Lacal (Instituto de Investigaciones Biomédicas, Мадрид, Испания), а плазмиды, кодирующие wt и доминантно-отрицательные Akt и p110CAAX, были получены от J. Downward (Imperial Cancer Исследовательский фонд, Лондон, Великобритания). Плазмида, кодирующая PDK1, была предоставлена ​​К. Андерсоном (Институт Бабрахама, Кембридж, Соединенное Королевство). Помеченные гемагглютинином (HA) формы Akt и PKCζ, а также myrAkt были предоставлены J. S.Гуткинд (Национальный институт стоматологических и черепно-лицевых исследований, Национальные институты здравоохранения, Бетесда, штат Мэриленд). Плазмида pCDNApRb, кодирующая кДНК pRb человека дикого типа (щедрый подарок от S. Mittnacht) под контролем промотора цитомегаловируса (CMV), была описана ранее (22, 23). pVM6NTermK10 (NTerm) был создан путем вставки фрагмента Hin dIII- Sac I, кодирующего NTerm (23), в вектор pVM6 (Boehringer Mannheim) в рамке с тегом G вируса везикулярного стоматита (VSV-G) под контролем промотора CMV.pRasNTerm был создан путем вставки фрагмента, кодирующего NTerm, в рамку с последовательностью, кодирующей Ha-ras, в последовательность, кодирующую карбоксильный конец pRas [61] ΔF (6). Целостность конструкций подтверждена секвенированием. Трансфекцию с использованием фосфата кальция или фугена 6 (Boehringer Mannheim) выполняли, как описано ранее (22–27). После отбора в течение 15-25 дней в присутствии подходящих антибиотиков (G418 [0,5 мг / мл] или гигромицин [0,1 мг / мл] или обоих для котрансфекций) эксперименты по колониеобразующей эффективности были выполнены, по крайней мере, в трех повторностях (22-24). .Если не указано иное, клетки котрансфицировали одним и тем же количеством плазмид, кодирующих K10 и разные сигнальные молекулы (5 мкг каждой на чашку p90). Общее количество ДНК поддерживали постоянным во всех экспериментах по трансфекции, включая соответствующие количества пустого вектора pcDNA3. Относительное количество колоний рассчитывали, принимая за 100% количество колоний, полученных с пустыми векторами в каждой клеточной линии. Данные представлены как средние значения ± стандартное отклонение (SD).

Культура клеток и иммунофлуоресценция.

Кератиноцитов HaCaT, PB и MCA3D, а также клетки C33A и BMGE + H культивировали, как описано ранее (21-25). Для иммунофлуоресцентного анализа после трансфекции клетки культивировали, фиксировали и окрашивали, как описано ранее (22-24), с использованием антител против кератина K10 (неразбавленные супернатанты мышиных моноклональных антител [MAb:] Lh2, Lh3 или Lh4 или разбавленные 1/40. K8.60 мышиные MAb) (21–25). PKCζ (Santa Cruz Biotechnology или Boehringer Mannheim; оба кроличьих поликлональных антитела используются в разведениях 1/200 и 1/400 соответственно), Akt (Upstate Biotechnology или Santa Cruz Biotechnology; оба козьих поликлональных антитела используются в разведениях 1/250 и 1/300. соответственно), фосфорилированного Akt (Upstate Biotechnology или BioLabs; оба кроличьих поликлональных антитела, используемых в разведениях 1/200 и 1/100 соответственно), и мышиное MAb против метки VSV-G, разведенное 1/100 (Boehringer Mannheim).Обычно выполняли контроли, включая инкубацию с предиммунной сывороткой, исключая первичное антитело, и предварительную инкубацию с иммунизирующим пептидом. Вторичные антитела, специфичные для множественной маркировки, были приобретены в Jackson Immunoresearch Labs и использованы, как описано ранее (21-25). Анализы включения бромдезоксиуридина (BrdU) и опосредованного терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой dUTP-биотина, ник-конца мечения (TUNEL) выполняли в основном, как описано ранее (23, 24), с использованием крысиного MAb против BrdU (23) и меченого флуоресцеином изотиоцианатом (FITC) клеток. набор для обнаружения смерти (Boehringer Mannheim) параллельно с иммунофлуоресценцией K10 (разведение 1/40 антитела K8.60). Образцы анализировали с помощью конфокального микроскопа Bio-Rad C600 или обычного иммунофлуоресцентного микроскопа Axiophot (22–27). Эксперименты проводили в трех экземплярах; в каждой оценивали не менее 200 трансфицированных клеток. Для тройной иммунофлуоресценции одновременно использовали меченные AMCA антимышиные антитела, конъюгированные с техасским красным антитела и конъюгированные с FITC антитела против кролика.

Иммунопреципитация, иммуноблоттинг и киназные анализы.

Для коиммунопреципитации экстракты клеток получали в фосфопротеиновом буфере (20 мМ Трис [pH 7.5], 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ EGTA, 1% Тритон X-100, 2,5 мМ пирофосфат натрия, 1 мМ β-глицеринфосфат, 1 мМ Na ₃ VO ₄ , 1 мкг лейпептина / мл , 1 мкг апротинина / мл, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид). Белковые экстракты (50 мкг в 500 мкл фосфопротеинового буфера) инкубировали при перемешивании (в течение ночи при 4 ° C) в присутствии 2 мкл антител против K10 (мышиные MAb K8.60), Akt и PKCζ (поликлональные антитела козы и кролика. соответственно, от Santa Cruz Biotechnology), или метку против VSV-G (мышиные MAb от Boehringer Mannheim).Растворимые и обогащенные кератином фракции получали по существу, как описано ранее (25). Экстракты общего белка, фракции, обогащенные цитоскелетом, и иммунопреципитаты анализировали с помощью вестерн-блоттинга, как описано ранее (22–27), с использованием тех же антител против Akt, PKCζ, фосфорилированного Akt и метки VSV-G, описанных в разделе «Культура клеток и иммунофлуоресценция». Мышиные MAb Lh4 использовали для одновременного обнаружения K10 и ΔNΔC. Антитела против pRb, cycD1 и cycE были описаны ранее (22, 23).LI0025 был использован для обнаружения человеческого K16. Антитела, используемые в иммуноблоттинге, разводили от 1/1000 до 1/10 000 в трис-буферном солевом растворе, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина и 0,05% твин 20. Для нормализации нагрузки иммуноблоты окрашивали Ponceau S перед инкубацией антител. Киназную активность Akt и PKCζ из клеток HaCaT, котрансфицированных 5 мкг K10 или K16 и 2 мкг HA-меченых Akt или PKCζ, определяли при иммунопреципитации HA-специфическим MAb 12CA5 (Babco) с использованием гистона 2B (h3B) или основной белок миелина (MBP) в качестве субстрата.Вкратце, клетки промывали один раз холодным фосфатно-солевым буфером и лизировали на льду с помощью 1 мл лизирующего буфера, содержащего ингибиторы протеаз и фосфатаз (1% Triton X-100, 10% глицерин, 137 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl [pH 7.5], 1 мкг апротинина и лейпептина / мл, 1 мМ фенилметилсульфонилфторид, 20 мМ NaF, 1 мМ пирофосфат динатрия и 1 мМ Na ₃ VO ₄ ). После предварительной очистки образцов центрифугированием лизаты подвергали иммунопреципитации 1 мкл анти-HA MAb с использованием γ-связывающих гранул (Amersham Pharmacia Biotech) для осаждения иммунокомплексов.После трех промывок 1 мл буфером для лизиса, одной промывки 1 мл водой и одной промывки 1 мл киназным буфером (20 мМ HEPES [pH 7,4], 10 мМ MgCl ₂ , 10 мМ MnCl ₂ ) реакции проводили (30 мин при 25 ° C) в 30 мкл киназного буфера, содержащего 0,05 мг соответствующего субстрата / мл, 5 мкМ АТФ, 1 мМ дитиотреитола и 10 мкКи [γ- ³² P] АТФ. Продукты киназных реакций фракционировали в гелях додецилсульфат натрия — 15% полиакриламид и подвергали рентгенологическому облучению.В некоторых случаях клетки голодали по сыворотке в течение ночи перед лизисом. При необходимости те же самые мембраны затем зондировали вестерн-блоттингом с использованием мышиных анти-НА (Babco, 1: 500) или AE1 (23) MAb для оценки уровня экспрессии котрансфицированных белков.

Двухклеточные гибридные эксперименты.

Анализ взаимодействия между myrAkt и NTerm с помощью двухклеточного гибридного подхода был выполнен с использованием ras rescue system, модификации двухгибридной системы CytoTrap (Stratagene), как описано ранее (6).Вкратце, дрожжевые термочувствительные клетки cdc25-2 котрансформировали плазмидами, показанными на фиг. B. Трансформанты культивировали на планшетах для селекции и инкубировали при 25 или 37 ° C в течение 5 дней. Положительное взаимодействие определяли по выращиванию при 37 ° C в планшетах, содержащих галактозу. Отрицательный контроль включал чашки с минимальным содержанием галактозы и чашки с глюкозой (не показаны).

NTerm взаимодействует с Akt in vitro и in vivo. (A) Иммунопреципитация с использованием MAb против VSV-G экстрактов из объединенных клонов клеток HaCaT, меченных VSV-G, NTerm и трансфицированных вектором, с последующим вестерн-блоттингом против VSV-G, Akt и PKCζ, показывающим, что как Akt, так и PKCζ соосаждение с NTerm.(B) Двухклеточные гибридные эксперименты с использованием системы спасения ras (6). cdc25-2 Клетки дрожжей котрансформировали указанными плазмидами и высевали при разрешающей (25 ° C) или ограничительной (37 ° C) температуре на планшеты, содержащие галактозу. Обратите внимание, что помимо положительных контролей, включая экспрессию RasCAAX (1 и 3) и экспрессию pMyrMAFB плюс pSOSMAFB (6), рост при ограничительной температуре был получен с котрансформацией pMyrAkt плюс RasNTerm (4), что указывает на то, что белок-белковое взаимодействие между myrAkt и NTerm произошло.Отсутствие роста в 2 показывает, что NTerm сам по себе не может преодолеть мутацию cdc25-2 дрожжевых клеток. В качестве отрицательного контроля миристоилированную форму фосдукцина D (PhosD) котрансформировали с помощью pRasNTerm (5). Колоний не наблюдалось при 37 ° C в планшетах, содержащих глюкозу и обедненных галактозой, что указывает на то, что myrAkt сам по себе не способствует росту дрожжевых клеток (не показано).

РЕЗУЛЬТАТЫ

Ингибирование клеточной пролиферации, индуцированное K10, отменяется Akt и PKCζ.

Ранее мы продемонстрировали, что экспрессия кератина K10, но не мутанта K10, лишенного как амино, так и карбоксильных концов (ΔNΔC), вызывает остановку роста кератиноцитов HaCaT человека (23). Хотя мы также продемонстрировали, что этот эффект не зависит от p53 (23), учитывая, что этот белок мутирован в клетках HaCaT, мы проанализировали, способен ли кератин K10 подавлять рост клеток в других типах клеток. На фигуре A показано, что кератин K10 также препятствует росту клеток кератиноцитов кожи мыши (клетки MCA3D и PB) и клеток молочной железы крупного рогатого скота (BMGE + H).Однако, в соответствии с нашими предыдущими результатами (23), этот эффект не наблюдался в клетках карциномы шейки матки человека C33A, лишенных функционального pRb (рис. A).

Кератин-индуцированная модуляция пролиферации клеток связана с сигнальными эффекторами, принадлежащими к пути PI-3K. (A) Кератин K10 (светлые столбцы), но не форма ΔNΔC, у которой отсутствуют амино- и карбоксильные окончания (сплошные столбцы), ингибирует рост клеток в различных линиях эпителиальных клеток, включая кератиноциты человека (HaCaT) и мыши (MCA3D и PB) и клетки молочной железы крупного рогатого скота (BMGE + H), но не клетки Rb-дефицитной карциномы шейки матки человека (C33A).(B) Кератин K10 также опосредует ингибирование роста клеток HaCaT при совместной экспрессии с человеческим кератином K1, его естественным партнером в супрабазальных, дифференцирующих кератиноцитах эпидермиса (см. Введение). (C) Кератин K10-индуцированная остановка роста клеток кератиноцитов HaCaT устраняется совместной экспрессией Ha-ras, PDK1, Akt и PKCζ, но не v-raf, RhoA, Rac1, Cdc42 или активированной каталитической субъединицей PI-3K ( p110CAAX). (D) Вестерн-блоттинг с использованием мышиных MAb K8.60 (разведенных 1/10 000) в лизатах клеток, котрансфицированных K10 и указанными плазмидами, демонстрирующий, что уровни экспрессии K10 при этих трансфекциях аналогичны.(E) Колониеобразующие эксперименты, показывающие, что Akt устраняет ингибирование роста клеток, вызванное K10 в клетках HaCaT, дозозависимым образом. В качестве отрицательного контроля трансфекция возрастающих количеств плазмиды, кодирующей v-raf, существенно не улучшает способность этого белка обращать ингибирующий эффект K10. (F) Функции Akt и PKCζ необходимы для обеспечения нормального роста кератиноцитов HaCaT, что демонстрируется уменьшением количества колоний, полученных после трансфекции 10 мкг доминантно-отрицательных форм Akt или PKCζ (DNAkt и DNPKCζ, соответственно) относительно числа из аналогичных экспериментов по трансфекции с пустым вектором (pcDNA3).Доминантно-отрицательную форму Ha-ras (rasN17) использовали в качестве положительного контроля для ингибирования роста клеток. (G) Трансфекция кератина K10 ингибирует включение BrdU (сплошные столбцы), но не апоптоз (анализ TUNEL; светлые столбцы) в HaCaT. (H) Вестерн-блоты из белковых экстрактов pRb-дефицитных клеток C33A, временно котрансфицированных K10 или его неактивным мутантом ΔNΔC, pRb и p110CAAX, Akt, PKCζ или PDK1, демонстрирующие, что K10-индуцированная репрессия гиперфосфорилирования pRb и репрессия циклина D1 и экспрессия E восстанавливается совместной экспрессией PDK1, Akt или PKCζ, но не p110CAAX.Числа, кажущаяся молекулярная масса (в тысячах). Данные на панелях от A до C и от E до G получены как минимум из трех независимых экспериментов и показаны как средние значения ± стандартное отклонение.

Кератин K10 коэкспрессируется в эпидермисе с кератином K1, с которым он связывается с образованием промежуточных филаментов, характерных для дифференцирующихся кератиноцитов. Рисунок B демонстрирует, что вызванная K10 остановка роста клеток не может быть объяснена экспрессией этого кератина в отсутствие его естественного партнера, K1, поскольку котрансфекция K1-plus-K10 показала аналогичный или даже более сильный ингибирующий эффект (рис.Б).

Для изучения механизма, с помощью которого K10 изменяет клеточный цикл, мы провели эксперименты по спасению, в которых эффекторы, принадлежащие к сигнальному пути ras, котрансфицировали K10 с помощью анализа образования колоний, ранее использовавшегося для установления антипролиферативного эффекта K10 (23). Котрансфекция Ha-ras (V12), PDK-1, Akt или PKCζ снимала ингибирующий эффект K10, тогда как v-raf, RhoA, Rac1, Cdc42 и p110CAAX (постоянно активная каталитическая субъединица PI-3K) имели только частичный эффект (рис.C). Параллельные эксперименты показали, что K10 экспрессировался на сходных уровнях при этих котрансфекциях, указывая на то, что наблюдаемый эффект не был обусловлен различиями в уровне экспрессии трансфицированного-K10 (фиг. D). В этих экспериментах использовали равные количества плазмид, кодирующих K10 и различные эффекторные белки (5 мкг). Чтобы подтвердить специфичность этих спасений, были проведены эксперименты по формированию колоний, в которых возрастающие количества Akt или v-raf котрансфицировали в клетки HaCaT с фиксированным количеством K10.Результаты показали, что Akt устраняет ингибирующий эффект K10 дозозависимым образом (рис. E). Напротив, и как ожидалось, увеличение количества плазмиды, кодирующей v-raf, не приводило к значительному изменению способности этой киназы восстанавливать индуцированное K10 ингибирование роста клеток. Тот факт, что Akt и PKCζ, но не активная форма PI-3K, восстанавливают ингибирование роста, вызванное экспрессией K10, предполагает, что это ингибирование действует на уровне этих нижестоящих киназ, а не влияет на общую PI-3K-зависимую передачу сигналов.Кроме того, эти результаты показывают, что активность Akt и PKCζ необходима для нормальной пролиферации в клетках HaCaT. Чтобы проверить это, были проведены эксперименты по формированию колоний с клетками HaCaT, трансфицированными пустым вектором (в качестве контроля) или доминантно-отрицательными формами Akt (DNAkt) или PKCζ (DNPKCζ). Мы также включили доминантно-отрицательную форму ras (rasN17) в качестве положительного контроля ингибирования роста. Было обнаружено, что для пролиферации клеток HaCaT необходимы активности как Akt, так и PKCζ, поскольку доминантно-отрицательные формы этих киназ ингибируют образование колоний в той же степени, в какой это ингибируется rasN17 (рис.F).

Ранее мы показали, что экспрессия кератина K10 ингибирует развитие клеточного цикла за счет снижения экспрессии циклина D1, тем самым нарушая фосфорилирование pRb (23). Однако, учитывая четко установленную роль Akt в защите клеток от апоптоза, мы изучили возможную индукцию апоптоза в клетках HaCaT, трансфицированных кератином K10, с помощью анализа TUNEL. Параллельно мы проанализировали способность этих трансфицированных клеток включать BrdU. Результаты демонстрируют, что клетки, экспрессирующие K10, демонстрируют сильное ингибирование включения BrdU (рис.G), тогда как степень их апоптоза была аналогична степени апоптоза нетрансфицированных клеток (рис. G). Эти данные четко подтверждают предыдущий вывод о том, что экспрессия K10 вызывает остановку клеточного цикла, и указывают на то, что в отсутствие дополнительных внешних стимулов экспрессия K10 сама по себе не может индуцировать апоптоз.

Наконец, мы изучили, обращает ли спасение роста клеток, стимулируемое промежуточными продуктами передачи сигналов PI-3K, эти эффекты на аппарат клеточного цикла. Для этого Rb-дефицитные клетки C33A котрансфицировали плазмидами, кодирующими K10 и pRb, а также p110CAAX, Akt, PKCζ или PDK1.Ранее мы показали, что после трансфекции клеток C33A pRb этот белок эффективно фосфорилируется и индуцируется эндогенный белок циклин D1 (23, 24), и что эти эффекты подавляются котрансфекцией K10 (23). В настоящей работе эффективное гиперфосфорилирование трансфицированного pRb и повышенные уровни эндогенного циклина D1 и циклина E наблюдались, когда K10 котрансфицировали PDK1, Akt или PKCζ, но не p110CAAX (рис. H) (см. Ссылки в ссылках 23 и 24. ).Кроме того, ΔNΔC, неактивный мутант K10, лишенный как амино, так и карбоксильных концов (23), не ингибировал фосфорилирование pRb или экспрессию циклина D1 или циклина E (рис. H). Вместе эти результаты демонстрируют, что эффекторы сигнального пути PI-3K, но не сам PI-3K, обращают вспять эффекты K10 на молекулы, регулирующие пролиферацию и клеточный цикл.

В отличие от K10, K16 стимулирует пролиферацию кератиноцитов и отменяет вызванную K10 задержку роста (23). Чтобы определить, участвует ли эта стимуляция также в пути PI-3K, мы проанализировали способность трансфицированного K16 обратить действие специфических ингибиторов MEK (PD098059) или PI-3K (вортманнин) (рис.А). При использовании в определенных концентрациях (5 мкМ и 100 нМ соответственно) эти препараты ингибируют MEK1 и PI-3K соответственно. Оба вызывали сильное ингибирование роста трансфицированных вектором (pcDNA3) клеток HaCaT, а также нетрансфицированных родительских кератиноцитов HaCaT (не показаны). Клетки, трансфицированные K16, также были чувствительны к ингибитору MEK, но K16, по-видимому, отменяет ингибирование, вызванное вортманнином. Вестерн-блоттинг показал одинаковые уровни K16 во всех случаях (фиг. B), указывая на то, что наблюдаемые эффекты нельзя отнести к различиям в экспрессии K16.

Экспрессия K16 устраняет ингибирование роста, вызванное ингибированием PI-3K. (A) Колониеобразующие эксперименты, демонстрирующие, что ингибирование роста, вызванное вортманнином (Calbiochem; 100 нМ), но не ингибитором MEK PD098059 (Calbiochem; 5 мкМ), эффективно устраняется экспрессией K16. (B) Вестерн-блоттинг, показывающий, что уровень экспрессии трансфицированного K16 в клетках, обработанных вортманнином, аналогичен уровню экспрессии в клетках, обработанных PD098059. ДМСО, клетки, трансфицированные К16, обработанные одним диметилсульфоксидом.

Трансфицированный K10 взаимодействует с эндогенными Akt и PKCζ и предотвращает их активацию в кератиноцитах человека.

Результаты, показывающие, что эффекторы пути PI-3K, но не сам активный PI-3K, реверсируют K10-индуцированную остановку клеточного цикла, предполагают, что K10 может ингибировать функцию таких эффекторов. PI-3K-зависимые сигналы вызывают изменения внутриклеточной локализации специфических киназ, включая Akt и PKCζ (1, 9). Возможное объяснение ингибирующего действия K10 может заключаться в том, что присутствие этого кератина предотвращает такие транслокации.Это также может объяснить, почему сверхэкспрессия wt форм этих киназ обращает K10-индуцированную остановку клеточного цикла. Чтобы проверить эту гипотезу, мы трансфицировали K10 в клетки HaCaT и изучили локализацию эндогенных Akt и PKCζ с помощью двойной иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии. В нетрансфицированных клетках эти киназы имеют диффузную ядерную и цитоплазматическую локализацию (рис. 3A ‘, B’, E и F). Напротив, в клетках, экспрессирующих трансфицированный K10, этот кератин собирается в эндогенные кератиновые промежуточные филаменты (рис.A и B) и большая часть Akt (Fig. 3A ‘) и PKCζ (Fig. 3B’) явно колокализуются вдоль этих филаментов. Такая совместная локализация не была обнаружена, когда клетки HaCaT были трансфицированы неактивным в клеточном цикле мутантом K10 ΔNΔC (рис. C, C ‘, D и D’), хотя этот мутантный кератин также интегрирован в промежуточные филаменты, образованные эндогенными кератинами. Эксперименты вестерн-блоттинга также продемонстрировали, что этот эффект нельзя отнести к разной экспрессии K10 и ΔNΔC, поскольку эти конструкции экспрессируются на сходных уровнях при трансфекции в клетках HaCaT (рис.ГРАММ).

Akt и PKCζ совместно локализуются с кератиновым цитоскелетом в клетках, трансфицированных K10, но не мутантной формой, лишенной как амино-, так и карбоксильных концов (ΔNΔC). Клетки HaCaT временно трансфицировали K10 (A и B) или ΔNΔC (C и D) и анализировали с помощью двойной иммунофлуоресценции и конфокальной микроскопии для визуализации трансфицированного кератина (с использованием мышиных MAb Lh4; от A до D) и эндогенного Akt (с использованием козье поликлональное антитело; A ‘и C’) или PKCζ (с использованием поликлонального антитела кролика; B ‘и D’).(E и F) Распределение эндогенных PKCζ (E) и Akt (F) в нетрансфицированных клетках HaCaT (см. Также стрелки на панелях A ‘и B’). Обратите внимание, что K10, но не ΔNΔC, изменяет распределение эндогенных киназ с дисперсной на нитевидную форму, так что распределение колокализуется с распределением K10. Сходные результаты были получены с двумя разными антителами, индуцированными против разных эпитопов Akt или PKCζ (не показаны). Стрелки (A ‘и B’) — нетрансфицированные клетки. Показаны репрезентативные примеры из трех независимых экспериментов.(G) Вестерн-блоттинг с использованием MAb Lh4, демонстрирующий, что K10 и ΔNΔC экспрессируются в одинаковой степени в трансфицированных клетках HaCaT (см. Также фиг. B). Прутки, 10 мкм.

Измененное распределение Akt и PKCζ как следствие экспрессии K10 предполагает, что K10 вмешивается в транслокацию этих молекул на клеточную мембрану, тем самым предотвращая их активацию путем фосфорилирования (1, 9, 10, 15). Двойной иммунофлуоресцентный анализ фосфорилированных Akt в клетках, трансфицированных K10 или ΔNΔC, показал сильное снижение фосфо-Akt в клетках, экспрессирующих K10 (рис.А). Однако при трансфекции с неактивным мутантом ΔNΔC явно наблюдали, что значительные количества фосфо-Akt сохраняются в трансфицированных клетках (фиг. B). Наконец, чтобы определить, действительно ли экспрессия кератина ингибирует киназную активность Akt и PKCζ, клетки HaCaT котрансфицировали 2 мкг плазмид, кодирующих Akt или PKCζ, меченных HA, и 5 мкг плазмид, кодирующих K10 или K16. Активность соответствующей котрансфицированной киназы анализировали при иммунопреципитации, используя эпитоп НА и используя h3B и MBP в качестве субстратов для Akt и PKCζ, соответственно.Результаты (фиг. C и D) показали, что K10 снижает киназную активность как Akt (фиг. C), так и PKCζ (фиг. D) до уровней, аналогичных тем, которые были получены при трансфекции киназы в клетках с недостатком сыворотки. Напротив, котрансфекция K16 стимулировала обе киназные активности (фиг. C и D). Трансфицированные киназы и кератины постоянно экспрессировались на аналогичных уровнях в этих экспериментах, как определено с помощью вестерн-блоттинга (фиг. C и D и данные не показаны).

Нарушение активации эффекторов передачи сигналов PI-3K как следствие экспрессии K10, но не ΔNΔC.Клетки HaCaT, синхронизированные в G ₀ сывороточным голоданием, трансфицировали K10 (A) или ΔNΔC (B). Через 48 часов клеткам давали возможность повторно войти в клеточный цикл путем добавления сыворотки. Через 3 часа экспрессию трансфицированной конструкции (красный) и эндогенного фосфорилированного Akt (Akt-P; зеленый) анализировали с помощью непрямой двойной иммунофлуоресценции. Показанные изображения получены путем слияния двух каналов иммунофлуоресценции. Обратите внимание, что экспрессия K10 приводит к необнаруживаемым уровням Akt-P, тогда как в клетках, трансфицированных ΔNΔC, присутствует по крайней мере некоторое количество Akt-P (зеленый и желтый).(C и D) Экспрессия кератина изменяет активность Akt (C) и PKCζ (D). Клетки HaCaT трансфицировали K10 или K16 и HA-меченными Akt (C) или PKCζ (D), и активности киназ определяли после иммунопреципитации против эпитопа HA с использованием h3B и MBP, соответственно, в качестве субстратов (см. Материалы и методы). В нижних частях панелей C и D показаны иммуноблоты против HA-метки, демонстрирующие, что аналогичные количества иммунопреципитированных Akt и PKCζ обнаруживаются в соответствующих образцах. Показаны репрезентативные примеры из трех независимых экспериментов.Прутки, 15 мкм.

Akt и PKCζ взаимодействуют с K10 во время дифференцировки кератиноцитов.

Описанные выше результаты были получены при трансфекции кератина K10 в культивируемые кератиноциты. Чтобы определить, взаимодействует ли K10 также с Akt и PKCζ in vivo, мы проанализировали клеточное распределение этих киназ во время дифференцировки кератиноцитов. Поскольку небольшая часть клеток HaCaT спонтанно дифференцируется и индуцирует экспрессию K10 (4, 21, 27), мы сначала проанализировали распределение эндогенных Akt и PKCζ в этих спонтанно дифференцирующихся клетках с помощью двойной иммунофлуоресценции.Было обнаружено, что как Akt (фиг. A), так и PKCζ (не показано) изменили свое клеточное распределение и совместно локализовались с филаментами, содержащими эндогенный кератин K10 (фиг. 5A ‘). Чтобы биохимически подтвердить эти данные, конфлюэнтные культуры HaCaT индуцировали к дифференцировке посредством сывороточного голодания, как сообщалось ранее (22, 26, 27). Растворимые и обогащенные кератином фракции были получены (25) и исследованы с помощью вестерн-блоттинга. Было замечено, что в недифференцированных культурах Akt и PKCζ в основном присутствовали в растворимой фракции (рис.Б). Кроме того, небольшие количества этих ферментов наблюдались в обогащенной кератином нерастворимой фракции, вероятно, из-за присутствия некоторых спонтанно дифференцирующихся клеток в культуре, о чем свидетельствует присутствие кератина K10 в этой фракции (рис. B). Однако в дифференцированных клетках HaCaT как Akt, так и PKCζ были обнаружены во фракции кератина. Наконец, фосфорилированный, т.е. активный, Akt был обнаружен исключительно в растворимом пуле недифференцированных клеток. Эти результаты демонстрируют, что, как наблюдали при трансфекции (рис.), как Akt, так и PKCζ взаимодействуют с K10 во время дифференцировки кератиноцитов HaCaT.

Akt и PKCζ взаимодействуют с K10 во время дифференцировки кератиноцитов HaCaT. Спонтанно дифференцированные кератиноциты HaCaT (4, 27) фиксировали и анализировали с помощью непрямой иммунофлуоресценции для обнаружения эндогенных Akt (A) и кератина K10 (A ‘). Обратите внимание, что в дифференцирующихся клетках (стрелка), характеризующихся присутствием K10, картина окрашивания Akt изменяется, становясь нитевидной и совпадающей с таковой для кератина K10 (A ′ ′).(B) Akt и PKCζ связаны с кератинами в дифференцированных культурах кератиноцитов HaCaT. Клетки HaCaT индуцировали к дифференцировке путем сывороточного голодания в течение 12 дней (22, 26, 27), а растворимые (Sol) и обогащенные кератином фракции получали, как описано ранее (25), и анализировали вестерн-блоттингом с использованием антител против кератина K5, кератин K10, Akt, PKCζ и Akt-P. Растворимые и обогащенные кератином фракции из контрольных недифференцированных культур анализировали параллельно. Обратите внимание на присутствие большей части Akt, PKCζ и фосфорилированного Akt в растворимой фракции недифференцированных культур (отрицательный K10), тогда как в дифференцированных культурах Akt и PKCζ находятся в нерастворимой (Insol) -кератиновой фракции, которая содержит кератин K10.Сигнал K5 демонстрирует аналогичные нагрузки в образцах из контрольных и дифференцирующихся клеток.

Затем мы изучили распределение Akt, фосфо Akt и кератина K10 в коже новорожденных мышей. Анализ тройной иммунофлуоресценции продемонстрировал, что Akt (фиг. A) присутствует как в базальном, так и в супрабазальном отделах эпидермиса мыши. Фосфорилированный активный Akt был ограничен базальным пролиферативным слоем (рис. B), тогда как K10, как и ожидалось, экспрессировался исключительно в супрабазальных непролиферативных слоях (рис.C). Для дальнейшего подтверждения возможного взаимодействия Akt и PKCζ с K10 in vivo, полные экстракты кожи иммунопреципитировали антителами против Akt, PKCζ, кератина K5 (характерного для базальных клеток) и кератина K10 (присутствующего в супрабазальных клетках) и затем исследовали с помощью Вестерн промокание. K10 был обнаружен как в иммунопреципитатах Akt, так и в PKCζ, и аналогичным образом как Akt, так и PKCζ присутствовали в иммунопреципитатах K10, но не в иммунопреципитатах K5 (фиг. E). Фосфорилированный Akt был обнаружен в иммунопреципитатах Akt и PKCζ, но не в иммунопреципитатах K10 (рис.E), что указывает на то, что кератин K10 взаимодействует только с неактивными Akt. Наконец, стоит отметить, что Akt и PKCζ совместно преципитируют, что указывает на то, что эти две киназы взаимодействуют в эпидермисе in vivo. В совокупности эти результаты демонстрируют, что, как и в экспериментах по трансфекции K10, Akt и PKCζ взаимодействуют in vivo с K10 (присутствующим в дифференцирующихся постмитотических кератиноцитах), но не с K5 (присутствующим в компетентных к пролиферации кератиноцитах) и что, по крайней мере, для Akt, это взаимодействие может предотвратить его активацию.

Распределение Akt, Akt-P и K10 в коже новорожденных мышей. (От A до D) Замороженные срезы кожи новорожденных мышей обрабатывали для иммунофлуоресценции с использованием антител против Akt (A), Akt-P (B) и K10 (C). Три канала иммунофлуоресценции (техасский красный, флуоресцеинизотиоцианат и AMCA соответственно) показаны объединенными на панели D. Обратите внимание, что Akt присутствует во всех эпидермальных слоях, тогда как фосфорилированный Akt присутствует исключительно в базальном слое, а K10 ограничен дифференцированным супрабазальные слои.Это показывает, что Akt и K10 коэкспрессируются в супрабазальных клетках, но только базальные, K10-отрицательные клетки имеют активные фосфорилированные Akt. Пунктирные линии — эпидермально-дермальная граница. (E) Иммунопреципитация-Вестерн-блоттинг для биохимического подтверждения взаимодействия K10-Akt-PKCζ в коже. Экстракты всей кожи подвергали иммунопреципитации (IP) указанными антителами и зондировали вестерн-блоттингом с антителами к белкам, указанными справа. Обратите внимание на присутствие K10, но не K5, в иммунопреципитатах Akt и PKCζ и наоборот, тогда как фосфорилированный Akt отсутствует в иммунопреципитатах K10.Также обратите внимание на отсутствие киназ в иммунопреципитатах K5. Пруток, 100 мкм.

Взаимодействие между Akt и PKCζ и K10 вовлекает не-спиральный аминоконцевой домен K10.

Ранее мы показали, что не-спиральные амино- и карбоксиконцевые домены K10 участвуют в способности K10 останавливать клеточный цикл и что мутантная форма ΔNΔC, в которой отсутствуют эти домены, неактивна (рис. A ) (23). Эти концы выступают из ядра филамента и могут опосредовать взаимодействие с другими белками.Мы проанализировали, участвует ли аминоконцевой домен K10 (NTerm) во взаимодействии с Akt или PKCζ. Сначала мы проанализировали, влияет ли он сам на пролиферацию клеток. Для этого кодирующую последовательность для этого фрагмента субклонировали под контролем промотора CMV в плазмиде pVM6 для обеспечения метки VSV-G и устойчивости к Neo. Эксперименты по образованию колоний показали, что NTerm не ингибирует пролиферацию клеток, как K10 (не показано). С другой стороны, котрансфекция возрастающих количеств NTerm отменяет ингибирующий эффект K10 в кератиноцитах HaCaT (рис.A) и восстанавливает гиперфосфорилирование pRb и экспрессию циклина D1 в клетках C33A (фиг. B), не влияя на экспрессию K10 (фиг. B). Это предполагает, что этот фрагмент взаимодействует с теми же белками, что и интактный K10, и что NTerm, присутствующий в возрастающих количествах, конкурирует с нитчатым K10.

Экспрессия NTerm облегчает вызванную K10 остановку роста клеток. (A) Колониеобразующие эксперименты с клетками HaCaT демонстрируют, что котрансфекция возрастающих количеств кодирующей NTerm плазмиды с 5 мкг кодирующей K10 плазмиды восстанавливает K10-промотированное ингибирование пролиферации клеток.(B) Подобные эксперименты по котрансфекции с клетками C33A в присутствии котрансфицированного pRb демонстрируют, что NTerm также восстанавливает фосфорилирование трансфицированного pRb и уровни эндогенного циклина D1. Два нижних раздела демонстрируют, что уровни экспрессии K10 и ΔNΔC аналогичны и что экспрессия возрастающих количеств NTerm не влияет на экспрессию K10. Отметим также, что, в отличие от K10, ΔNΔC не влияет на фосфорилирование pRb и уровни циклина D1. (C к D ») Примеры тройной иммунофлуоресценции после временной котрансфекции 5 мкг K10 и 5 мкг NTerm в клетках HaCaT, демонстрирующие, что совместная локализация K10 и эндогенных Akt и PKCζ отменяется в клетках, экспрессирующих NTerm.(C и D) Иммунофлуоресценция, визуализирующая K10. (C ‘и D’) Иммунофлуоресценция, визуализирующая Akt и PKCζ, соответственно. (C «и D») Иммунофлуоресценция, визуализирующая NTerm. Для сравнения см. Рис. A, A ‘, B и B’. Штанги (C и D), 15 мкм. Данные на панели A взяты из трех независимых экспериментов и представляют собой средние значения ± стандартное отклонение.

Поскольку NTerm растворим и не прикреплен к филаментам, белки, взаимодействующие с ним, могут подвергаться транслокации и активации. Чтобы проверить это, мы котрансфицировали равные количества (5 мкг) плазмид, кодирующих NTerm и K10, в клетки HaCaT.Распределение K10 (фиг. C и D), эндогенного Akt (фиг. 7C ‘) или PKCζ (фиг. D’) и NTerm (фиг. 7C «и D») анализировали с помощью иммунофлуоресценции. Как и предполагалось, было обнаружено, что присутствие NTerm нарушает взаимодействие между K10 и эндогенным Akt (сравните фиг. C и C ‘с фиг. A и A’) или PKCζ (сравните фиг. D и D ‘с фиг. B. и B ‘) и что киназы не взаимодействуют с кератином.

Затем мы изучали взаимодействие трансфицированного NTerm с эндогенными Akt и PKCζ путем иммунопреципитации с использованием метки против VSV-G с последующим вестерн-блоттингом.Было обнаружено, что NTerm взаимодействует с Akt и PKCζ (рис. A). Наконец, чтобы дополнительно подтвердить физическое взаимодействие между Akt и NTerm in vivo, мы провели эксперименты с двухклеточными гибридами с использованием системы ras rescue (6). Для этого кодирующую последовательность NTerm субклонировали в рамке считывания в плазмиду pRas [61] ΔF (6), заменяя сигнал CAAX, и шесть комбинаций плазмид, показанных на фиг. B, котрансформировали в дрожжевых клетках cdc25-2 . В этой системе (6) клетки могут расти при 25 ° C, но не при 37 ° C, если только это не происходит за счет межбелкового взаимодействия или экспрессии RasCAAX.Фактически мы обнаружили рост при ограничительной температуре только в положительном контроле (рис. B) и в клетках, котрансформированных миристоилированным Akt (myrAkt) и RasNTerm. Не было обнаружено роста ни с отрицательными контролями (фиг. B), ни с клетками, трансформированными только pMyrAkt (не показано). Это подтверждает, что не-спиральный аминоконцевой домен K10 взаимодействует in vivo с Akt.

ОБСУЖДЕНИЕ

Долгое время считалось, что функция кератина в основном структурная, до недавнего осознания того, что экспрессия кератина может влиять на пролиферацию и дифференцировку клеток (19, 23).Ранее мы продемонстрировали, что K10 ингибирует пролиферацию за счет снижения экспрессии циклина D1 и, таким образом, фосфорилирования pRb (23). Используя несколько подходов, мы здесь показываем, что эти эффекты обусловлены взаимодействием K10 с Akt и PKCζ, критическими эффекторами пути PI-3K. Мы также показываем, что это взаимодействие происходит во время дифференцировки кератиноцитов человека и мыши и затрагивает не-спиральный амино-конец этого белка, хотя мы не определили, происходят ли аналогичные взаимодействия также через не-α-спиральный карбоксильный конец K10. , который также участвует в остановке клеточного цикла (23).Связывание Akt и PKCζ с K10-содержащими филаментами предотвращает транслокацию этих киназ на мембрану и, таким образом, их активацию. Мы также демонстрируем, что это ингибирование отвечает за остановку клеточного цикла, вызванную K10.

Активность PI-3K, для которой Akt и PKCζ являются основными специфическими эффекторами, играет важную роль в контроле развития клеточного цикла. Например, активации PI-3K достаточно для входа в клеточный цикл фибробластов (14), а активация PI-3K и Akt в Т-лимфоцитах способствует фосфорилированию pRb и активации E2F (5).Точно так же экспрессия опухолевого супрессора PTEN, который дефосфорилирует фосфоинозитиды и, таким образом, действует против PI-3K, ингибирует прогрессирование клеточного цикла pRb-зависимым образом в фибробластах и ​​кератиноцитах (24, 31). Кроме того, Akt был идентифицирован как ключевой регулятор выживаемости клеток и, следовательно, онкогенеза. Фосфорилирование элементов цитоскелета, которое подразумевает взаимодействие с протеинкиназами, широко известно и, по-видимому, контролирует динамику цитоскелета (12, 16, 25).Однако здесь мы показываем, что взаимодействие кератина K10 с Akt и PKCζ также контролирует активность этих ферментов, ограничивая их перемещение и последующую активацию. Посредством этого механизма кератины влияют на пролиферацию, дифференцировку и апоптоз клеток. Ранее опубликованные данные также подтверждают возможное участие кератинов в процессах передачи сигналов.